文章題目：METTL16 exerts an m6A-independent function to facilitate translation and tumorigenesis

發(fā)表期刊：Nature Cell Biology (5年影響因子：24.2)

研究單位：Beckman Research Institute of City of Hope，The University of Chicago，City of Hope Comprehensive Cancer Center等。

主要內(nèi)容：METTL16作為一種最近被鑒定的RNA甲基轉(zhuǎn)移酶，可以對(duì)一些轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行m6A修飾。METTL16能否對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行RNA甲基化修飾目前尚不清楚。該研究揭示了METTL16在基因調(diào)節(jié)中表現(xiàn)出甲基轉(zhuǎn)移酶活性依賴和非依賴的雙重作用。在細(xì)胞核中，充當(dāng)m6A的writer將m6A“寫入"到數(shù)百個(gè)特定mRNA靶標(biāo)中。在細(xì)胞質(zhì)中，METTL16以一種m6A非依賴性方式促進(jìn)翻譯。METTL16通過(guò)Mtase結(jié)構(gòu)域與真核翻譯起始因子eIF3a/b和rRNA相互結(jié)合，促使翻譯起始復(fù)合體的組裝，并促進(jìn)超過(guò)4000條mRNA轉(zhuǎn)錄本的翻譯。此外，METTL16對(duì)肝細(xì)胞癌的腫瘤發(fā)生至關(guān)重要。總之，該研究揭示了METTL16在肝癌中通過(guò)RNA甲基化和翻譯調(diào)控的雙重功能促進(jìn)腫瘤發(fā)生。

研究意義：該研究揭示了METTL16不僅通過(guò)m6A修飾調(diào)控基因表達(dá)，還通過(guò)與eIF3a/b和rRNA相互作用促進(jìn)翻譯起始，從而推動(dòng)腫瘤生長(zhǎng)。靶向METTL16/eIF3a/eIF3b軸可能代表癌癥治療的新策略，未來(lái)開發(fā)針對(duì)METTL16 Mtase結(jié)構(gòu)域的有效抑制劑，可能為癌癥治療提供新的方向。

研究結(jié)果：

1. METTL16的m6A修飾功能

METTL16是METTL家族成員之一，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，少量分布于細(xì)胞核，這與主要位于細(xì)胞核的METTL3/14不同。研究發(fā)現(xiàn)，METTL16可以對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行m6A修飾，但其全局m6A修飾程度低于METTL3/14。通過(guò)m6A MeRIP-seq和QQQ-MS分析，發(fā)現(xiàn)METTL16缺失導(dǎo)致3075個(gè)轉(zhuǎn)錄本的m6A豐度顯著降低，其中334個(gè)是METTL16特異性靶標(biāo)，主要參與細(xì)胞周期、凋亡、RNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等過(guò)程。此外，METTL16在新轉(zhuǎn)錄RNA的m6A修飾中起重要作用，尤其是在外顯子中。

圖1. METTL3，METTL14和METTL16的亞細(xì)胞分布和對(duì)m6A的的催化活性比較分析。

2. METTL16促進(jìn)全局翻譯效率

METTL16不僅參與m6A修飾，還顯著提高翻譯效率。實(shí)驗(yàn)表明，METTL16顯著提高熒光素酶的翻譯效率，甚至超過(guò)METTL3。METTL16缺失明顯減弱蛋白質(zhì)合成，且這種抑制不能通過(guò)METTL3/14的高表達(dá)恢復(fù)。METTL16定位于5'cap區(qū)域，參與翻譯起始過(guò)程，表明其在翻譯調(diào)控中的重要作用。Ribo-seq鑒定了METTL16 KO介導(dǎo)的翻譯抑制事件，這些差異TE轉(zhuǎn)錄本主要在RNA結(jié)合、RNA加工、細(xì)胞周期和mRNA代謝過(guò)程等途徑中富集。

圖2. METTL16提高了靶RNA的翻譯效率。

3. METTL16與eIF3a/b結(jié)合促進(jìn)翻譯啟動(dòng)

METTL16通過(guò)與翻譯起始因子eIF3a/b直接結(jié)合，促進(jìn)翻譯起始。Co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)METTL16與eIF3a/b直接互作，且這種相互作用不受RNA影響。原位鄰位連接分析（PLA）進(jìn)一步驗(yàn)證了METTL16與eIF3a/b在細(xì)胞質(zhì)中的物理相互作用。Polysome profiling分析發(fā)現(xiàn)METTL16和eIF3a/b在40/60/80S核糖體中富集，表明其參與翻譯起始過(guò)程。METTL16介導(dǎo)的翻譯起始與其甲基轉(zhuǎn)移酶活性無(wú)關(guān)。

圖3. METTL16通過(guò)與eIF3a和eIF3b直接結(jié)合，促進(jìn)翻譯啟動(dòng)。

4. METTL16的Mtase結(jié)構(gòu)域在翻譯調(diào)控中的作用

METTL16的Mtase結(jié)構(gòu)域（79-289aa）直接與eIF3a/b結(jié)合，對(duì)METTL16介導(dǎo)的翻譯效率至關(guān)重要。通過(guò)截短突變體實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Mtase結(jié)構(gòu)域?qū)τ贛ETTL16與eIF3a/b和5'cap的結(jié)合是不可少的。此外，METTL16在胞質(zhì)中發(fā)揮主要生物學(xué)作用，NLS突變體能夠恢復(fù)翻譯抑制和生長(zhǎng)抑制。

圖4. 翻譯調(diào)控既需要MTTL16的Mtase結(jié)構(gòu)域，也需其胞質(zhì)定位。

5. METTL16與rRNA相互作用促進(jìn)80S TIC的形成

METTL16通過(guò)與18S rRNA（40S核糖體亞基）和28S/5.8S rRNA（60S核糖體亞基）相互作用，促進(jìn)80S翻譯起始復(fù)合物（TIC）的形成。METTL16促進(jìn)eIF3復(fù)合物與40S核糖體亞基的相互作用，進(jìn)而促進(jìn)43S前起始復(fù)合物（PIC）的組裝和80S TIC的形成。核糖體圖譜分析顯示，METTL16缺失顯著減少了80S核糖體的形成。

圖5. METTL16與eIF3a/b和rRNA相互作用，促進(jìn)80S TIC的形成。

6. METTL16在肝細(xì)胞癌（HCC）中起促瘤作用

METTL16在肝癌患者中表達(dá)顯著升高，且與預(yù)后差相關(guān)。METTL16缺失顯著抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵入。通過(guò)回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)野生型METTL16恢復(fù)METTL16 KO誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制，而催化失活突變體只能部分恢復(fù)。METTL16的Mtase結(jié)構(gòu)域?qū)CC細(xì)胞的生存至關(guān)重要，且其致癌作用需要Mtase結(jié)構(gòu)域。異種移植小鼠模型顯示，METTL16缺失在體內(nèi)顯著抑制HCC腫瘤的形成和進(jìn)展。

圖6. 在肝癌中METTL16起重要的促進(jìn)作用。

m6A MeRIP-seq聯(lián)合Ribo-seq的研究思路

1. 研究背景

m6A（N6-甲基腺苷）是常見(jiàn)的RNA修飾，影響mRNA的穩(wěn)定性、翻譯和降解。m6A MeRIP-seq（甲基化RNA免疫共沉淀測(cè)序）用于全基因組水平檢測(cè)m6A修飾，而ribo-seq（核糖體圖譜測(cè)序）則用于研究翻譯過(guò)程。聯(lián)合這兩種技術(shù)可以揭示m6A修飾對(duì)翻譯的調(diào)控機(jī)制。

2. 研究目標(biāo)

1)     確定m6A修飾在轉(zhuǎn)錄組中的分布。

2)     分析m6A修飾對(duì)翻譯效率的影響。

3)     探索m6A修飾在特定生物過(guò)程中的作用。

3. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.1 樣本準(zhǔn)備

1)     選擇合適的細(xì)胞系或組織樣本。

2)     分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，如敲除m6A甲基轉(zhuǎn)移酶或去甲基化酶的細(xì)胞。

3.2 m6A MeRIP-seq

1)     RNA提取與片段化。

2)     使用m6A特異性抗體進(jìn)行免疫沉淀。

3)     建庫(kù)測(cè)序，識(shí)別m6A修飾位點(diǎn)。

3.3 Ribo-seq

1)     提取核糖體保護(hù)的RNA片段。

2)     建庫(kù)測(cè)序，分析翻譯效率（TE）。

3.4 數(shù)據(jù)分析

1)     m6A MeRIP-seq數(shù)據(jù)分析：識(shí)別m6A峰，定位修飾位點(diǎn)。

2)     ribo-seq數(shù)據(jù)分析：計(jì)算翻譯效率，識(shí)別翻譯活躍區(qū)域。

3)     聯(lián)合分析：整合m6A MeRIP-seq和Ribo-seq數(shù)據(jù)，識(shí)別受m6A調(diào)控的翻譯事件。比較m6A修飾與翻譯效率的關(guān)系，識(shí)別受m6A調(diào)控的基因。

4)     功能富集分析：GO和KEGG分析受m6A調(diào)控的基因功能。

5)     網(wǎng)絡(luò)分析：構(gòu)建m6A修飾與翻譯調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)。

4. 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1)     qPCR驗(yàn)證m6A修飾和翻譯效率的變化。

2)     Western blot驗(yàn)證目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

3)     CRISPR/Cas9編輯m6A修飾位點(diǎn)，驗(yàn)證功能。

5. 預(yù)期結(jié)果

1)     繪制全基因組m6A修飾圖譜。

2)     了解受m6A調(diào)控的翻譯事件列表。

3)     揭示m6A在特定生物過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制。

6. 研究意義

1)     深化對(duì)m6A修飾功能的理解。

2)     全面解析m6A修飾對(duì)翻譯的調(diào)控機(jī)制。

3)     為疾病治療提供新靶點(diǎn)。